Поље биотехнологија је једна од сталних промена. Брз раст и развој врхунских истраживања зависе од иновације и креативности научници и њихова способност да виде потенцијал у основној молекуларној техници и примене га на ново процеси. Појава ланчане реакције полимеразе (ПЦР) отворио је многа врата у генетском истраживању, укључујући средства за ДНК анализа и идентификација различитих гена на основу њихових ДНК секвенци. Редослед ДНК такође зависи од наше способности коришћења гел електрофореза да одвојимо ланце ДНК који се разликују по величини за само један основни пар.
ДНК секвенцирање
У касним 1970-им, пронађене су две технике секвенцирања ДНК за дуже молекуле ДНК: метода Сангер (или дидеокси) и метода Макам-Гилберт (хемијско цепање). Макам-Гилберт метода се заснива на цепању хемикалијама специфичним за нуклеотиде и најбоље се користи за секвенционирање олигонуклеотида (кратки нуклеотидни полимери, обично дужине мање од 50 парова база). Сангер метода се чешће користи јер је технички доказано да се лакше наноси, а са Појавом ПЦР-а и аутоматизацијом технике, лако се примењује на дуге нити ДНК, укључујући неке целине гени. Ова техника се заснива на прекиду ланца дидеоксинуклеотидима током ПЦР реакција издуживања.
Сангер Метход
У методи Сангер, ДНК ланац који се анализира користи се као образац, а ДНК полимераза се користи у ПЦР реакцији за генерисање комплементарних ланаца помоћу прајмера. Припремљене су четири различите ПЦР реакционе смеше, а свака садржи одређени проценат аналога дидеоксинуклеозид трифосфата (ддНТП) на један од четири нуклеотида (АТП, ЦТП, ГТП или ТТП).
Синтеза новог ланца ДНК траје све док један од ових аналога није уграђен, у које време је лан прерано одрезан. Свака ПЦР реакција ће на крају садржати смешу различитих дужина ланца ДНК, а све се завршава нуклеотидом који је дидеокси означен за ту реакцију. Гел електрофореза затим се користи за одвајање ланаца четири реакције, у четири одвојене траке, и одређивање редоследа оригиналног шаблона на основу којих дужина ланаца се завршава нуклеотидом.
У аутоматској Сангеровој реакцији користе се прајмери који су обележени са четири различите флуоресцентне ознаке у боји. ПЦР реакције, у присуству различитих дидеоксинуклеотида, изводе се као што је горе описано. Међутим, затим се четири реакционе смеше комбинују и наносе на једну траку гела. Боја сваког фрагмента детектира се ласерским снопом, а информације прикупља рачунар који ствара хроматограме који приказују врхове за сваку боју, из чега се може налазити ДНК секвенца одлучно.
Обично је метода аутоматизованог секвенцирања тачна само за секвенце дужине до око 700-800 базних парова. Међутим, могуће је добити пуне секвенце већих гена и, заправо, целих генома, користећи поступне методе, као што су Пример Валкинг и Схотгун секвенцирање.
У Прајмер ходању, обрадиви део већег гена секвенциониран је методом Сангер. Нови прајмери су генерисани из поузданог сегмента секвенце и коришћени су за наставак секвенцирања дела гена који је био изван распона оригиналних реакција.
Редослед пуцања укључује насумично сечење ДНК сегмента који је од интереса за више погодних (управљани) фрагменти величине, редоследе сваког фрагмента и уређивање делова на основу преклапања секвенце. Ова техника је олакшана применом рачунарског софтвера за сређивање комада који се преклапају.