Како ланчана реакција полимеразе ради на појачавању гена

Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је молекуларна генетичка техника за прављење више копија гена и такође је део процеса секвенцирања гена.

Копије гена се праве помоћу узорка ДНК, а технологија је довољно добра да направи више копија од једне копије гена пронађеног у узорку. ПЦР амплификација гена за прављење милиона копија, омогућава детекцију и идентификацију генских секвенци коришћењем визуелних техника заснованих на величини и наелектрисању (+ или -) дела ДНК.

У контролисаним условима, мале сегменте ДНК генеришу ензими познати као ДНК полимеразе, који додају комплементарне деоксинуклеотиде (дНТП) на део ДНК познат као „шаблон“. Чак и мањи делови ДНК, названи "прајмери" се користе као полазна тачка за полимераза.

Прајмери ​​су мали вештачки делови ДНК (олигомери), обично дуги између 15 и 30 нуклеотида. Настају познавањем или нагађањем кратких ДНК секвенци на самим крајевима гена који се појачава. Током ПЦР-а, ДНК која се секвенцира се загрева и двоструки ланци се раздвајају. Након хлађења, прајмери ​​се везују за шаблон (који се назива жарење) и стварају место за почетак полимеразе.

Ланчана реакција полимеразе (ПЦР) је омогућена открићем термофила и термофилних ензими полимеразе (ензими који одржавају структурни интегритет и функционалност након загревања при високој температуре). Кораци укључени у ПЦР технику су следећи:

• Смеша се ствара, са оптимизованим концентрацијама ДНК шаблона, ензима полимеразе, прајмера и дНТП. Способност загревања смеша без денатурације ензима омогућава денатурацију двоструког хеликса узорка ДНК на температурама у опсегу од 94 степена Целзијус.
• Након денатурације, узорак се хлади на умеренији опсег, око 54 степена, што олакшава жарење (везивање) прајмера за једноланчане ДНК шаблоне.
• У трећем кораку циклуса, узорак се поново загрева на 72 степена, што је идеална температура за Так ДНК полимеразу, за продужење. Током елонгације, ДНК полимераза користи оригинални појединачни ланац ДНК као шаблон за додавање комплементарних дНТП-а до 3’ крајева сваког прајмера и генеришу део дволанчане ДНК у региону гена од интереса.
• Прајмери ​​који су жарени са ДНК секвенцама које се не подударају у потпуности не остају жарени на 72 степена, чиме се ограничава елонгација на ген од интереса.

Овај процес денатурације, жарења и елонгације се понавља више (30-40) пута, чиме се експоненцијално повећава број копија жељеног гена у смеши. Иако би овај процес био прилично заморан ако би се изводио ручно, узорци се могу припремити и инкубирати у а Програмабилни термоциклер, сада уобичајен у већини молекуларних лабораторија, а потпуна ПЦР реакција се може извести у 3-4 сата.

Сваки корак денатурације зауставља процес елонгације претходног циклуса, скраћујући тако нови ланац ДНК и задржавајући га на приближно величини жељеног гена. Трајање циклуса елонгације може се продужити или скратити у зависности од величине гена од интереса, али на крају, кроз поновљене циклусе ПЦР, већина шаблона ће бити ограничена само на величину гена од интереса, јер ће бити генерисани од производа оба прајмери.

Постоји неколико различитих фактори за успешан ПЦР којима се може манипулисати да би се побољшали резултати. Метода која се најчешће користи за тестирање присуства ПЦР производа је електрофореза у агарозном гелу. Који се користи за раздвајање фрагмената ДНК на основу величине и набоја. Фрагменти се затим визуализују коришћењем боја или радиоизотопа.

Од открића ПЦР-а, откривене су ДНК полимеразе које нису оригиналне Так. Неки од њих имају бољу способност „лекторирања“ или су стабилнији на вишим температурама, чиме се побољшава специфичност ПЦР-а и смањују грешке од уметања погрешног дНТП-а.

Неке варијације ПЦР-а су дизајниране за специфичне примене и сада се редовно користе у молекуларно генетичким лабораторијама. Неки од њих су ПЦР у реалном времену и ПЦР са реверзном транскриптазом. Откриће ПЦР-а је такође довело до развоја секвенцирања ДНК, ДНК отисак прста и друге молекуларне технике.