Поступак гремних мрља у микробиологији

Мрља по Граму је различита метода бојења која се користи за доделавање бактерије једној од две групе (грам-позитивна и грам-негативна) на основу својстава њихове ћелијске зидове. Познат је и под називом Грам обојење или Грамова метода. Процедура је именована за особу која је развила технику, дански бактериолог Ханс Цхристиан Грам.

Поступак се заснива на реакцији пептидогликана у ћелијским зидовима неких бактерија. Мрља по Граму укључује бојење бактерија, фиксирање боје мордантом, деколорирање ћелија и наношење контраста.

1. Примарна мрља (кристално љубичаста) везује се за пептидогликан, бојући ћелије љубичасто. И грам-позитивне и грам-негативне ћелије имају пептидогликан у својим ћелијским зидовима, тако да у почетку све бактерије обоје љубичасто.
2. Грамов јод (јод и калијум јодид) примењују се као средство за лучење или фиксатив. Грам-позитивне ћелије формирају кристално љубичасти јодни комплекс.
3. Алкохол или се ацетон користи за деколоризацију ћелија. Грам-негативне бактерије имају много мање пептидогликана у својим ћелијским зидовима, тако да их је овај корак у основи безбојан, док је само део боје уклоњен из грам-позитивних ћелија које имају више пептидогликана (60-90% ћелијске стијенке). Дебела ћелијска стијенка грам-позитивних ћелија дехидрира се поступком уклањања боје, узрокујући да се скупљају и задржавају комплекс мрља-јод изнутра.
   instagram viewer
4. Након корака уклањања боје, наноси се контрастаин (обично сафранин, али понекад и фуксин) за обојење бактерија у ружичасто. И грам-позитивне и грам-негативне бактерије покупе ружичасту мрљу, али није видљива преко тамније љубичасте грам-позитивне бактерије. Ако се поступак бојења изведе правилно, грам-позитивне бактерије ће бити љубичасте, док грам-негативне бактерије ће бити ружичасте.

Резултати мрље по Граму су приказани употребом светлосне микроскопије. Пошто су бактерије обојене, не само да је идентификована њихова група по Граму, већ и њихов облик, величина и образац се могу уочити. Због тога је мрља по Граму драгоцено дијагностичко средство за медицинску клинику или лабораторију. Иако мрља не може дефинитивно идентификовати бактерије, често је познато да ли су грам-позитивне или грам-негативне довољно за прописивање ефикасног антибиотика.

Неке бактерије могу бити грам-варијабилне или грам-неодређене. Међутим, чак и ове информације могу бити корисне у сужавању бактеријског идентитета. Техника је најпоузданија када су културе старија од 24 сата. Иако се може користити на културама бујона, најбоље је прво их центрифугирати. Примарно ограничење технике је да даје погрешне резултате ако се у техници направе грешке. За постизање поузданог резултата потребна је вештина и вештина. Такође, заразни узрочник можда није бактеријски. Еукариотски патогени мрље грам-негативно. Међутим, већина еукариотске ћелије осим што се гљиве (укључујући квас) током процеса не придржавају клизача.

• Кристална љубичица (примарна мрља)
• Грамов јод (мордант, за фиксирање кристалне љубичице у ћелијском зиду)
• Етанол или ацетон (средство за уклањање боје)
• Сафранин (секундарна мрља или контраста)
• Вода у бочици са капаљком или бочицом за капаљке
• Микроскопски слајдови
• Састављени микроскоп

1. На слајд ставите малу кап узорка бактерија. Топлина фиксира бактерије на тобоган пролазећи кроз пламен Бунсен горионика три пута. Примјењујући превише топлоте или предуго може отопити зидове ћелија бактерија, нарушавајући њихов облик и довести до нетачног резултата. Ако се поднесе мало топлоте, бактерије ће испрати клизање током бојења.
2. Помоћу капаљке нанесите примарну мрљу (кристалну љубичицу) на клизач и оставите је да одстоји 1 минут. Нежно исперите клизач водом не дуже од 5 секунди да бисте уклонили сувишне мрље. Дуго испирање може уклонити превише боје, а ако се не испире довољно дуго може оставити превише мрља на грам-негативним ћелијама.
3. Помоћу капаљке нанесите Грамов јод на клизач да бисте фиксирали кристалну љубичицу на ћелијску стијенку. Оставите га да одстоји 1 минут.
4. Клизање исперите алкохолом или ацетоном око 3 секунде, а затим их лагано исперите водом. Грам-негативне ћелије ће изгубити боју, док ће грам-позитивне ћелије остати љубичасте или плаве боје. Међутим, ако се деколоризатор остане предуго, све ћелије ће изгубити боју!
5. Нанесите секундарну мрљу, сафранин и оставите да одстоји 1 минут. Њежно исперите водом не дуже од 5 секунди. Грам-негативне ћелије требају бити обојене црвено или ружичасто, док ће грам-позитивне ћелије и даље изгледати љубичасто или плаво.
6. Прегледајте слајд користећи сложени микроскоп. Увећање ће бити потребно од 500к до 1000к да би се разликовао облик и распоред ћелија.

Нису све бактерије идентификоване флеком по Граму повезане са болестима, али неколико важних примера укључује:

• Грам-позитивни коки (у кругу):Стапхилоцоццус ауреус
• Грам-негативни коци:Неиссериа менингитидис
• Грам-позитивне бациле: Бациллус антхрацис
• Грам-негативни бацили:Есцхерицхиа цоли