Методе за прочишћавање протеина у биотехнологији

Важна компонента биотехнолошких истраживања је употреба техника инжењерских протеина за дизајн или модификацију протеина. Ове технике пречишћавања протеина оптимизују својства протеина за специфичне индустријске примене.

Ове технике захтевају од научника да изолују и пречишћују протеине који су од интереса да би се могле проучавати њихове конформације и специфичности супстрата. Такође су потребне студије реакције са другим лигандима (протеин који се веже за протеин рецептора) и специфичне активности ензима.

Степен чистоће протеина који је потребан зависи од планиране крајње употребе протеина. За неке примене довољан је сирови екстракт. За остале намене, као што су храна и фармацеутски производи, потребан је висок ниво чистоће. Неколико техника за пречишћавање протеина користе се за постизање потребног нивоа чистоће.

Сваки корак прочишћавања протеина обично резултира неким степеном губитка производа. Стога је идеална стратегија прочишћавања протеина она у којој се у најнижим корацима постиже највиши ниво прочишћавања.

Одабир корака за употребу зависи од величине, набоја, растворљивости и других својстава циљног протеина. Следеће технике су најприкладније за пречишћавање једног цитосолног протеина.

Прочишћавање цитосолних протеинских комплекса је компликованије и обично захтева примену различитих метода.

Први корак у пречишћавању интраћелијских (унутар ћелије) протеина је припрема сировог екстракта. Екстракт ће садржавати сложену мешавину свих протеина из ћелијске цитоплазме, и неких додатних макромолекула, кофактора и хранљивих материја.

Овај сирови екстракт може се користити за неке примене у биотехнологији. Међутим, ако је питање чистоће потребно је следити следеће кораке пречишћавања. Сирови протеински екстракти се припремају уклањањем ћелијских отпадака насталих лизијом ћелија, што се постиже коришћењем хемикалија, ензими, соницатион или Френцх Пресс.

Крхотине се уклањају центрифугирањем, а супернатант (течност изнад чврстог остатка) је прикупљен. Сирови препарати ванћелијских (ван ћелија) протеина могу се добити једноставним уклањањем ћелија центрифугирањем.

Извесно биотехнологија примене, постоји потражња за термостабилним ензимима - ензимима који могу да подносе високе температуре без денатурирања, а да притом одржавају високу специфичну активност.

Организми који производе протеине отпорне на топлоту понекад се називају и екстремофили. Лак приступ чишћењу протеина отпорног на топлоту је денатурирање осталих протеина у смеши загревањем, а затим хлађењем раствора (на тај начин омогућавајући термостабилни ензим да се реформише или поново разблажи, ако неопходно). Денатурирани протеини се могу уклонити центрифугирањем.

Модеран биотехника протоколи често користе бројне комерцијално доступне сетове или методе који пружају готова решења за стандардне поступке. Пречишћавање протеина се често врши помоћу филтера и припремљених колона са гел-филтрацијом.

Слиједите упуте за дијализу и додајте праву количину правог рјешења и причекајте одређено време током сакупљања елуанса (растварач је прошао кроз колону) у новом испитивању цев.

Хроматографске методе могу се применити употребом столних столица или аутоматизоване ХПЛЦ опреме. Раздвајање ХПЛЦ-ом може се извршити методом обрнуте фазе, измјеном јона или искључивањем величине и узорцима откривеним диодним низом или ласерском технологијом.

У прошлости, чест други корак пречишћавања протеина из сировог екстракта било је таложењем у раствору високе осмотске чврстоће (тј. Раствора соли). Таложење протеина се обично врши употребом амонијум сулфата као соли. Нуклеинске киселине из сировог екстракта могу се уклонити таложењем агрегата који су формирани стрептомицин сулфатом или протамин сулфатом.

Таложење соли обично не доводи до високо прочишћеног протеина, али може помоћи у уклањању неких нежељених протеина у смеши и концентрисањем узорка. Соли у раствору се затим уклањају дијализом кроз порозну целулозну цев, филтрацију или кроматографијом за искључивање гела.

Различити протеини ће се исталожити у различитим концентрацијама амонијум сулфата. Опћенито, протеини веће молекулске тежине се таложе у нижим концентрацијама амонијум сулфата.

Реверзно-фазна хроматографија (РПЦ) раздваја протеине на основу њихове релативне хидрофобности (искључење неполарних молекула из воде). Ова техника је веома селективна, али захтева употребу органских растварача.

Неки протеини су трајно денатурирани растварачима и изгубит ће функционалност током РПЦ-а. Због тога се ова метода не препоручује за све примене, посебно ако је неопходно да циљни протеин задржи активност.

Ион-изменљива хроматографија односи се на одвајање протеина на основу набоја. Ступци се могу припремити за анионску размену или за замену катиона. Ступови за анионску размену садрже стационарну фазу са позитивним набојем који привлачи негативно наелектрисане протеине.

Стубови за катионску размену су обрнуте, негативно наелектрисане куглице које привлаче позитивно набијене протеине. Елуција (екстрахирање једног материјала из другог) циљног протеина врши се променом пХ у колона, што резултира променом или неутрализацијом набијених функционалних група сваке од њих протеин.

Хроматографија за искључивање величине (позната и као гел филтрација) одваја веће протеине од мањих оне јер већи молекули брже путују кроз умрежени полимер у хроматографији колона. Велики протеини се не уклапају у поре полимера, док мањи протеини имају дуже време и путују кроз колону хроматографије, мање директним путем.

Елуат (резултат елуције) је сакупљен у серију епрувета које раздвајају протеине на основу времена елуције. Гел филтрација је корисно средство за концентрирање узорка протеина, јер се циљни протеин сакупља у мањој запремини елуције него што је иницијално додан у колону. Сличне технике филтрирања могу се користити током производње великих протеина великих количина због њихове исплативости.

Афинитна хроматографија је веома корисна техника за „полирање“, односно завршавање процеса пречишћавања протеина. Зрнца у колони хроматографије умрежена су у лиганде који се специфично везују за циљни протеин.

Затим се протеин уклања са колоне испирањем раствором који садржи слободне лиганде. Ова метода даје најчишће резултате и највећу специфичну активност у поређењу с другим техникама.

СДС-ПАГЕ (натријум додецил сулфат коришћен са електрофорезом полиакриламидног гела) веже се за протеине што им даје велики нето негативан набој. Будући да су набоји свих протеина прилично једнаки, ова метода их одваја готово у потпуности на основу величине.

СДС-ПАГЕ се често користи за тестирање чистоће протеина након сваког корака у низу. Како се нежељени протеини постепено уклањају из смеше, број трака визуелизованих на СДС-ПАГЕ гелу се смањује, све док не постоји само једна трака која представља жељени протеин.

Имуноблотинг је техника визуелне примене протеина која се примењује у комбинацији са афинитетном хроматографијом. Антитела за одређени протеин се користе као лиганди на колони афинитетне хроматографије.

Циљни протеин се задржава на колони, затим се уклања испирањем колоне раствором соли или другим средствима. Антитела повезана са радиоактивним или бојама помажу у откривању циљног протеина након што се одвоји од остатка смеше.